ADN Polimerasa Termoestable
Para Uso Exclusivo en Laboratorios de Investigación
Descripción:
Amplificasa® Es una ADN-Polimerasa termoestable recombinante que proviene de Thermus acuaticus¹. Es una enzima recombinante expresada en E.coli, la cual es altamente purificada por cromatografía de intercambio iónico. Su actividad se ajusta a 5 unidades/ul. Amplificasa® puede ser utilizada en laboratorios de investigación y diagnóstico en diversos procesos de amplificación, secuenciación, y marcaje de ADN².
Nuestras presentaciones contienen:
| Amortiguador de Reacción 10X : | (100 mM Tris-HCl pH 8.4; 500 mM KCl; 100 µg/ml gelatina, 1.5 mg/ml BSA; 1% Tritón X100). |
| Cloruro de Magnesio: | (30 mM). |
| Amplificasa® : | (5 Unidades/ul). |
Control de Calidad de Amplificasa®: Se tiene el sumo cuidado de que esta enzima tenga la misma actividad de lote a lote. El análisis de la enzima en geles de poliacrilamida-SDS (10%) muestra una sola banda de 94 kDa. Estabilidad térmica: Vida media es de ~40 minutos a 95ºC y 10 minutos a 98ºC. No se detecta actividad de endonucleasas o exonucleasas.
Amortiguador de Almacenamiento de la Enzima: HEPES 20mM pH 7, KCl 100mM, EDTA 0.1mM, PMSF 0.5mM, DTT 1mM, glicerol 50% v/v.
Durabilidad. La vida media es de 4 años cuando la enzima se almacena a -20ºC.
Referencias:
1.- Kaledin, A.S., Slyusarenko, A.G. and Gorodetskii, S.I. (1980) Biokhimya 45:644-651.
2.- Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White; T.J. (1990). PCR protocols: A guide to methods and applications, Academic Press.
CONDICIONES DE AMPLIFCACION DE ADN
Las reacciones de PCR son realizadas generalmente en un volumen de 20 µl conteniendo: 1X PCR buffer, 1 pmol/µl de cada iniciador, 0.2mM dNTP, 0.25 U Taq ADN polimerasa y 25-100 ng DNA genómico ó 1 ng de ADN de plásmido.
Típicamente las reacciones de amplificación se preparan mezclando:
| INGREDIENTES | VOLUMEN 20 ul |
| Amortiguador de Reacción 10X | 2 µl |
| Cloruro de Magnesio (30 mM). [1.5 mM final] |
1 µl |
| Iniciadores 10 µM de cada uno ("Forward y Reverse") [1 uM final] |
1-2 µl |
| Deoxinucléotidos (dNTP) 2.0 mM [0.2mM final] |
2 µl |
| Amplificasa® (5U/µl) | 0.1 µl |
| DNA genómico 25 ng/ µl | 1-4 µl |
| H2O | cbp 20 µl |
Notas: Si con sus reactivos experimentales, la reacción de amplificación no funciona, se recomienda variar básicamente dos parámetros:.- La temperatura de reasociación. 2.- La concentración de MgCl2.. En general , se aumenta o reduce la especificidad de la amplificación al incrementar o reducir la temperatura y/o la concentración de MgCl2 : A mayor temperatura de reasociación, mayor especificidad; a mayor concentración de MgCl2 , menor especificidad y viceversa. Cuando el producto de amplificación es muy débil o no aparece, puede ayudar incluir en la reacción formamida ó DMSO (3% final).
Condiciones de Amplificación:
Las condiciones mas comunes de amplificación son las siguientes:
1 ciclo (94ºC, 3 min); 30 ciclos [Paso de desnaturalización (94ºC por 30 seg); Paso de asociación (temperatura específica para cada juego de iniciadores por 30 seg); Paso de extensión (72ºC, por el tiempo relativo al tamaño del amplificado: para segmentos menores de 500pb use 30 seg, fragmentos de 2 Kbp use hasta 2 min). 1 ciclo final (72ºC, 3 min)
MARCADORES MOLECULARES DE ADN. RANGO BAJO
ADN pBR322/ Msp I
Descripción:
El ADN de pBR322 digerido con la endonucleasa de restricción Msp I tiene 26 fragmentos en un rango de 622 a 9 pares de bases (ver tabla 1).. En este rango se obtienen comúnmente los productos de PCR. El ADN está a una concentración de 0.05 µg /µl en amortiguador de carga (Ficoll 400 5%, EDTA 40 mM y azul de bromofenol 0.02 %). El producto viene listo para ser usado directamente en geles de agarosa o poliacrilamida. Se recomienda aplicar 3-5 µl/carril, dependiendo del tamaño del pozo. En geles de agarosa al 3% se pueden observar claramente 11 fragmentos (ver Figura.1).
Control de Calidad:
El ADN es purificado por ultracentrifugación en gradientes de cloruro de cesio. En geles de agarosa no se detecta la presencia de ARN, ADN bacteriano. No se identifica actividad de endonucleasas o exonucleasas.
Almacenamiento:
Este producto es estable a temperatura ambiente, sin embargo se recomienda guardarlo a 4ºC ó por periodos prolongados a -20ºC.
Referencias:
1.- Bolivar, F. et al. (1977) Gene 2:95-113.
2.- Watson, N. (1988) Gene 70:399-403.